В связи со все возрастающей потребностью страны в специалистах с высшим образованием правительство вынуждено было открывать новые учебные заведения. В Киеве в первой четверти XIX в. имелось лишь одно высшее учебное заведение — Киевская академия. В 1819 году ее преобразовали в духовную академию.
8 ноября 1833 года был подписан указ об открытии университета в Киеве, а 2 декабря того же года одобрен и его устав, который действовал вплоть до 1842 года.

После большой подготовительной работы 15 июля 1834 года состоялось официальное открытие университета. В первом учебном году здесь обучалось 62 человека, в т. ч. 57 дворян. В 1856 году из 867 студентов дети дворян и высокопоставленных чиновников составляли 725 человек, духовенства — 57, промышленников, купцов и почетных граждан — 73, дети зажиточных крестьян — 13 человек{Киевский облгосархив, ф. 804, оп. 1, д. 14, л. 123.}.

Первым ректором Киевского университета стал выдающийся ученый, человек прогрессивных взглядов М. А. Максимович, до 1834 года работавший в Московском университете (окончил его в 1823 году). Ученый опубликовал свыше 100 научных работ, преимущественно по ботанике и зоологии. Большую исследовательскую работу он провел в области истории и филологии{«Вісник АН УРСР», 1965, № 20, С. 55—65.}.

Киевский университет вначале имел два факультета: философский, состоявший из двух отделов — историко-филологического и физико-математического, и юридический. Занятия начались 9 сентября 1834 года — вначале на философском факультете, а в 1835 году — и на юридическом. Среди ученых-преподавателей юридического факультета были К. А. Неволин, С. Н. Орнатский и др. На факультете работал видный юрист Н. Д. Иванишев.

В университете имелись кабинеты: физический, химический, зоологический, минералогический и нумизматики, а также ботанический сад и типография. Вопреки намерениям царя, усматривавшего задачу университета в том, чтобы воспитывать из студентов верноподданных чиновников, он стал крупным центром научной мысли на Украине и в России, очагом культуры и одним из центров революционно-освободительного движения в стране.

Начиная с 40-х годов в университете все большее развитие получает научно-исследовательская работа. В течение 1841—1845 гг. построена астрономическая обсерватория, первым директором ее был профессор В. Ф. Федоров. В 1841 году в университете открылся медицинский факультет, деканом которого стал ученик и последователь II. И. Пирогова — профессор В. А. Караваев. Он был не только талантливым хирургом, но и прекрасным лектором. В. А. Караваев работал в университете около 50 лет. Вместе с ним на медицинском факультете преподавали Н. И. Козлов, С. П. Алферьев, Ф. С. Ципурин и другие ученые, внесшие значительный вклад в развитие отечественной медицинской науки.

Когда в 1848 году в странах Западной Европы вспыхнула революция, вновь «ожили и зашевелились умы в университете св. Владимира», как писал один из профессоров. Николай I, чтобы пресечь всякое проявление свободомыслия, прибегнул к крайним реакционным мерам. Вместо С. С. Уварова министром просвещения с 1850 года стал другой реакционер — П. А. Ширинский-Шихматов, педантично выполнявший все указания царя. Репрессии в университете настолько усилились, что его деятельность пришла в упадок. На юридическом факультете работали только три профессора. Несколько кафедр остались без руководителей.

В 1835 году в Киеве был образован Временный комитет для исследования древностей, куда вошли М. А. Максимович, С. Ф. Зенович, С. Н. Орнатский, В. Ф. Цих и др. За 10 лет своего существования комитет провел значительную работу. По его инициативе при университете открыли Музей древностей. М. А. Максимович выпустил в 1840—1841 гг. в Киеве две книги альманаха «Киевлянин», третья книга издана в Москве в 1850 году. В них были опубликованы интересные материалы по истории Киева. М. А. Максимович, исследуя историю Киевской Руси, повел решительную борьбу против норманнской теории происхождения древнерусского государства. Материалы по этнографии, статистике и истории Киева печатались также на страницах газеты «Киевские губернские ведомости», которая начала выходить в 1838 году.

Истории Киева были посвящены книги Н. В. Закревского — украинского историка, фольклориста, этнографа, лингвиста, писателя. В 1836 году в Ревеле (ныне Таллин) вышла его работа «Очерк истории города Киева». Впоследствии она была дополнена, переработана и издана в Москве отдельным томом в двух частях под названием «Описание Киева».

Большую исследовательскую работу проводила Временная комиссия для разбора древних актов (Археографическая комиссия), созданная в Киеве при канцелярии генерал-губернатора в 1843 году. Главная ее задача заключалась в собирании, изучении и публикации исторических документов. С 1845 года, после ликвидации Временного комитета для исследования древностей в Киеве, на комиссию были возложены обязанности выявлять и исследовать археологические памятники. Комиссия находилась в помещении университета и состояла в основном из его профессоров — М. А. Максимовича, Н. И. Костомарова, Н. Д. Иванишева и др.{Рудько М. П. Тарас Шевченко і Київський університет. К., 1959, с. 8; Попов П. М. Шевченко і Київський університет. К., 1964, с. 13.}. В течение 1845—1859 гг. ею издано четыре тома «Памятников» по истории Украины XVI—XVIII вв. Отдельными изданиями вышли «Летопись» Г. И. Грабянки, два тома «Жизни князя А. М. Курбского в Литве и на Волыни». По инициативе комиссии в 1852 году создан Киевский центральный архив древних актов.

В городе проводились значительные археологические работы. Был открыт фундамент Десятинной церкви. Еще в 1832—1833 гг. раскопаны остатки Золотых ворот. В 1843 году в Софийском соборе обнаружены фрески XI века.

С 1851 по 1864 год при университете действовала Комиссия для описания губерний Киевского учебного округа, в состав которой входили профессора университета В. Г. Бессер, К. Ф. Кесслер, А. С. Рогович и др. Комиссия исследовала фауну и флору Киевской, Подольской, Волынской и Черниговской губерний. В течение 1851—1861 гг. было издано четыре тома ее работ. Особое значение для изучения экономики феодально-крепостнического общества имели труды ее ученого секретаря, статистика Д. П. Журавского, в частности «Статистическое описание Киевской губернии», изданное в 1852 году. Этот труд высоко оценивал Н. Г. Чернышевский{Чернышевский Н. Г. Полное собрание сочинений, т. 3. М., 1947, с. 387.}.

Киевскому университету всегда оказывали бескорыстную помощь ученые других университетов страны. Его почетными членами были известные русские ученые Н. Н. Зинин, М. В. Остроградский, Н. И. Пирогов и другие.